emfret成立于2002年，emfret公司專注心血管和血液系統(tǒng)研究用抗體研發(fā)和生產(chǎn)，emfret公司的抗體不僅適用于
流式分析、WB檢測，還可用于免疫組化/免疫熒光及免疫共沉淀檢測。
產(chǎn)品列表
貨號 | 產(chǎn)品名稱 | 規(guī)格 |
M011-0 | mouse GPVI | 0.1mg |
M011-1 | mouse GPVI | 1.5mL |
M025-0 | Integrin alphaIIbbeta3 (GPIIb/IIIa, CD41/CD61) | 0.5mg |
M025-1 | Integrin alphaIIbbeta3 (GPIIb/IIIa, CD41/CD61) | 1.5mL |
M025-2 | Integrin alphaIIbbeta3 (GPIIb/IIIa, CD41/CD61) | 1.5mL |
M025-3 | Integrin alphaIIbbeta3 (GPIIb/IIIa, CD41/CD61) | 1.5mL |
M021-0 | Integrin alphaIIbbeta3 (GPIIb/IIIa, CD41/CD61) | 0.5mg |
M021-1 | Integrin alphaIIbbeta3 (GPIIb/IIIa, CD41/CD61) | 1.5mL |
M022-0 | Integrin alphaIIbbeta3 (GPIIb/IIIa, CD41/CD61) | 0.5mg |
M023-2 | Integrin alphaIIbbeta3 (GPIIb/IIIa, CD41/CD61) | 1.5mL |
M024-0 | Integrin alphaIIb (GPIIb, CD41) | 6mg |
M030-0 | Integrin beta3 chain (GPIIIa, CD61) | 0.5mg |
M031-0 | Integrin beta3 chain (GPIIIa, CD61) | 0.5mg |
M031-1 | Integrin beta3 chain (GPIIIa, CD61) | 1.5mL |
M040-0 | GPIbalpha (CD42b) | 0.5mg |
M040-1 | GPIbalpha (CD42b) | 1.5mL |
M040-2 | GPIbalpha (CD42b) | 1.5mL |
M040-3 | GPIbalpha (CD42b) | 1.5mL |
M041-0 | GPIbalpha (CD42b) | 0.5mg |
M041-1 | GPIbalpha (CD42b) | 1.5mL |
M042-0 | GPIbalpha (CD42b) | 0.5mg |
M042-1 | GPIbalpha (CD42b) | 1.5mL |
M043-0 | GPIbalpha (CD42b) | 0.5mg |
M043-1 | GPIbalpha (CD42b) | 1.5mL |
M050-0 | GPIbbeta (CD42c)mouse and human | 0.5mg |
M050-1 | GPIbbeta (CD42c)mouse and human | 1.5mL |
M051-0 | GPIX (CD42a) | 0.5mg |
M051-1 | GPIX (CD42a) | 1.5mL |
M060-1 | GPV (CD42d) | 1.5mL |
M061-0 | GPV (CD42d) | 0.5mg |
M061-1 | GPV (CD42d) | 1.5mL |
M070-0 | Integrin alpha2 chain (CD49b, GPIa) | 0.5mg |
M070-1 | Integrin alpha2 chain (CD49b, GPIa) | 1.5mL |
M071-0 | Integrin alpha2 chain (CD49b, GPIa) | 0.5mg |
M071-1 | Integrin alpha2 chain (CD49b, GPIa) | 1.5mL |
M080-0 | Integrin alpha5 chain (CD49e)mouse and human | 0.5mg |
M080-1 | Integrin alpha5 chain (CD49e)mouse and human | 1.5mL |
M110-0 | CD9 | 0.5mg |
M110-1 | CD9 | 1.5mL |
M120-0 | CD31 (PECAM-1) | 0.5mg |
M130-0 | CD62P (P-selectin) | 0.5mg |
M130-1 | CD62P (P-selectin) | 1.5mL |
M130-2 | CD62P (P-selectin)（靶點科技現(xiàn)貨） | 1.5mL |
P150-1 | von Willebrand Factor (vWF) | 1.5mL |
P140-1 | fibrinogen | 1.5mL |
P180-1 | negative control | 1.0mL |
P190-1 | negative control | 1.0mL |
P190-2 | negative control | 1.0mL |
P190-3 | negative control | 1.0mL |
R300 | Antibodies for Mouse Platelet Depletion（靶點科技常年現(xiàn)貨） | 0.5mg |
C301 | Antibodies for Mouse Platelet Depletion | 0.5mg |
D200 | Two-Color Analysis of Mouse Platelet Activation（靶點科技現(xiàn)貨） | 2.0ml |
X488 | In Vivo Mouse Platelet Labeling | 0.1mg |
X649 | In Vivo Mouse Platelet Labeling | 0.1mg |
抗體相關實驗技術Protocols
一、小鼠血小板表面糖蛋白的流式細胞術分析
緩沖液和試劑準備：
Tris緩沖鹽水/肝素（TBS/Hep）：20mM Tris/HCl；137mM NaCl；pH 7.3；含有20U/ml肝素。
磷酸鹽緩沖液（PBS）：137mM NaCl；2.7mM KCl；1.5mM KH2PO4；8mM Na2HPO4；pH 7.14。
改良臺氏液/改良Tyrode''s溶液：134mM NaCl；0.34mM Na2HPO4；2.9mM KCl；12mM NaHCO3；20mM Hepes；pH 7.0；5mM葡萄糖；0.35%（w/v）牛血清白蛋白。
腺苷三磷酸雙磷酶Apyrase：溶于水（10 U/mL），在-20°C下儲存。
前列環(huán)素Prostaglandin（Prostaglandin 2, PGI2）：溶于水（1 mM），在-20°C下儲存。
CaCl2：1 M溶于水。
稀釋或洗滌全血的制備：
1、用肝素化玻璃毛細管（如環(huán)帽）從眶后神經(jīng)叢抽取50µL血液，放入1.5 ml含有200µLTris緩沖鹽水/肝素（20 U/ml）的試管中。
2、在1 mL Tyrode緩沖液中稀釋，用于流式細胞儀分析。
3、為了制備洗滌過的血液，將稀釋的血液以900 x g離心5分鐘，去除上清液，并將沉淀重懸在1.25 mL Tyrode緩沖液中。
4、在實驗開始前直接加入1mM CaCl2。
注：對于凝血酶誘導的血小板活化，必須去除血漿以防止抗凝血酶活性。
血小板制備：
1、制備洗滌過的血小板是一種更耗時的方法，需要大量的血液，但產(chǎn)生的血小板制劑可以使用數(shù)小時。
2、用1.5 cm玻璃毛細管從眶后叢收集0.5-1 mL血液，放入含有200 µL TBS/肝素（20 U/ml）的1.5 mL管中。去除含有一些紅細胞的上清。
3、以500 x g離心樣品5分鐘，并將富含血小板的血漿（PRP）轉移到新的試管中。
4、將血小板懸浮液以300 x g離心8分鐘，并將不含任何紅細胞的PRP轉移到新的試管中。
5、加入0.5 µM前列環(huán)素（PGI2），以1300 x g離心5分鐘。
6、將血小板顆粒重新懸浮在1 mL Tyrode緩沖液中，加入0.02 U/mL腺苷三磷酸雙磷酶和0.5 µM前列環(huán)素，在37℃下孵育5分鐘，并在1300 x g下離心5分鐘。
7、重復步驟5，將血小板顆粒重懸于0.5 ml Tyrode緩沖液中，加入0.02 U/mL腺苷三磷酸雙磷酶，并在37℃下孵育30分鐘。
血小板表面糖蛋白的單色分析：
1、將5 µL特異性或陰性對照抗體和25 µL稀釋的全血在分析管中混合，渦旋混勻1-2秒。
2、在室溫下孵育15分鐘。
3、加入400 µL PBS停止反應，并在30分鐘內(nèi)進行分析。
如所述，將樣品與FITC綴合的對照IgG（黑線）、GPVI抗體或GPV抗體孵育。血小板通過前向散射（FSC）/側散射（SSC）血小板通過前向（FSC）/側向（SSC）散射特征進行篩選。在單獨的直方圖中顯示了被篩選（R1）的血小板的熒光（FL1）強度。RBC：紅細胞。
血小板活化的雙色分析：
1、將5 µL特異性或陰性對照抗體與5 µL泛血小板標記物一起加入測定管中。
2、此時，加入小體積（<5 µL）的任何額外的試劑（如抑制劑）。
3、加入26 µL稀釋的全血或經(jīng)洗滌過的血小板（100萬），渦旋混勻1-2秒。
在室溫下孵育15分鐘。加入400 µL PBS停止反應，并在30分鐘內(nèi)進行分析。
小鼠血小板分別與PBS或0.1U/mL的凝血酶（thrombin）一起與FITC和PE結合的mAbs一起孵育。通過GPIX或GPIIbIIIa（FL1; gate 1）的表達對血小板進行了篩選。
二、免疫組織化學（用丙酮固定冷凍切片）
請注意：不建議在（對）甲醛固定的樣本上進行免疫組織化學染色，因為大多數(shù)大鼠抗體在這些條件下對小鼠組織的效果很差。
1、將冷凍組織的切片放在玻片上，并在4°C下的冰冷100%丙酮中固定20分鐘。在室溫下干燥一整夜。
2、為了減少試劑的用量，在玻片上的組織切片周圍可以用防水筆畫一個疏水圈。在所有后續(xù)的步驟中，這個圈起來的區(qū)域都不應該干燥。因此，建議在潮濕的盒子中進行孵育步驟。
3、在PBS中孵育玻片20分鐘。
4、使用過氧化物酶結合的二抗時，將玻片在室溫下與0.03%的H2O2孵育10分鐘以抑制內(nèi)源過氧化物酶活性。在PBS中三次洗滌玻片，每次5分鐘。
5、用PBS稀釋（比例1:10或1:100）的封閉液（二抗體宿主物種的血清），室溫下孵育玻片1小時。
6、一抗（2-10 µg/ml）室溫孵育2小時。
7、吸取多余液體，然后在PBS中洗滌三次，每次5分鐘。
8、用熒光素或過氧化物酶結合的二抗（例如：親和純化的驢抗大鼠IgG-FITC或HRP）覆蓋玻片，按照說明書在封閉液中稀釋，室溫下孵育1小時。
9、吸取多余液體，PBS洗滌三次，每次5分鐘。
10、熒光染色的樣本可以直接通過熒光顯微鏡分析。
11、為了可視化過氧化物酶標記的組織，用新鮮制備的3-氨基-9-乙基咔唑（AEC）底物覆蓋玻片，并在顯微鏡下可見紅色染色，時間可在5至30分鐘之間變化。在橙色背景染色出現(xiàn)之前，用去離子水沖洗停止反應。用伊紅染色30-240秒，然后在溫水中沖洗玻片20分鐘。使用水溶性封裝溶液固定切片。
三、免疫沉淀
緩沖液和試劑準備：
PBS/EDTA：137mM NaCl、2.7mM KCl、1.5mM KH2PO4、8.0mM Na2HPO4 x 2H2O，pH 7.3；5 mM EDTA。
IP緩沖液：40 mM Tris/HCl、0.3 M NaCl、1 mM EDTA、2 mM PMSF、10µg/mL Leupeptin蛋白酶抑制劑、10µg/mL Aprotinin抑肽酶、1µg/mL Pepstatin胃蛋白酶抑制劑。
Igepal非離子表面活性劑：10%的H2O溶液。
2x SDS樣品緩沖液：10%β-巰基乙醇（用于還原緩沖液）、10%Tris緩沖液（1.25 M）、20%甘油、4%SDS、0.02%溴酚藍。
1、將小鼠血小板或細胞在1 mL PBS/EDTA（5分鐘，1300 x g）中洗滌3次，并使用IP緩沖液重懸。
2、加入1%Igepal 在室溫下溶解血小板（15–20分鐘）。
3、10000 x g下離心5分鐘去除細胞碎片，并將上清液轉移到新的試管中。
4、加入20µL洗滌過的protein G agarose（PGA）。在4°C下混勻孵育至少3小時。
5、3000 x g離心樣品5分鐘。將上清液轉移到新的試管中，以說明書中給定的濃度（通常在2-5µg/mL之間）加入抗體，30分鐘后加入25µL洗滌過的PGA。在4°C下混勻孵育至少2小時，最好過夜。
6、將樣品在3000 x g下離心1分鐘，向PGA中加入1 mL含有1%Igepal的1 x IP緩沖液。在3000 x g下離心1分鐘。
7、用IP緩沖液中洗滌PGA兩次（3000 x g離心1分鐘）。
8、加入25µL 1x SDS樣品緩沖液（還原或非還原），將PGA重懸，煮沸5分鐘。9、然后將樣品冷凍（-20°C）以備日后使用，或者進行SDS-PAGE和免疫印跡分析。
四、免疫印跡分析（Western Blot Analysis）
緩沖液和試劑準備：
裂解緩沖液：40mM Tris/HCl、0.3M NaCl、1mM EDTA、0.05%NaN3、1%Igepal。
PBS：137 mM NaCl、2.7 mM KCl、1.5 mM KH2PO4、8.0 mM Na2HPO4 x 2H2O，pH 7.3。
5%脫脂牛奶-PBS：含5%脫脂奶粉的PBS。
PBS/T：PBS含0.1%吐溫20。
1%脫脂牛奶-PBS/T：含1%脫脂牛奶的PBS/T。
所有步驟都可在室溫下進行：
1、在裂解緩沖液中制備小鼠血小板或細胞的裂解物，并與（2x）SDS樣品緩沖液在95°C下孵育5分鐘。
2、根據(jù)說明書，在還原或非還原條件下，通過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白質，并將蛋白質轉移到PVDF膜上。
3、用5%脫脂牛奶封閉膜1小時。
4、加入PBS/T-1%牛奶稀釋的一抗（2-5µg/mL），孵育1小時。
5、用PBS/T沖洗膜兩次，30分鐘。洗滌程序可以減少到三次，每次10分鐘。
6、加入PBS/T-1%牛奶稀釋的二抗（HRP偶聯(lián)的抗大鼠Ig），孵育45-60分鐘。
7、用PBS/T沖洗膜兩次，30分鐘。
8、使用ECL（化學發(fā)光）顯色。
Emfret熱賣產(chǎn)品
貨號 | 產(chǎn)品名稱 | 規(guī)格 | 品牌 |
R300 | Antibodies for Mouse Platelet Depletion（現(xiàn)貨） | 0.5 mg | emfret |
M023-2 | Integrin alphaIIbbeta3 (GPIIb/IIIa, CD41/CD61)（現(xiàn)貨） | 1.5mL | emfret |
X488 | anti - GPIbbeta derivative Rat IgG DyLight 488 in vivo platelet labeling | 100μg | emfret |
C301 | Sterile non-immune rat IgG（現(xiàn)貨） | 0.5 mg | emfret |
M040-1 | GPIbalpha (CD42b)（現(xiàn)貨） | 1.5 mL | emfret |
D200 | JON/A Rat IgG2b PE flow cytometry 1 mL | 200 tests | emfret |
X649 | In Vivo Mouse Platelet LabelingClone：anti - GPIbbeta derivative Isotype：Rat IgG 標記：DyLight 649 Appli（現(xiàn)貨） | 0.1mg | emfret |
M040-2 | Xia.G5 Rat IgG2b PE FC（現(xiàn)貨） | 1.5 mL | emfret |
M011-1 | JAQ1/ Rat (Wistar) IgG2a FITC FC（現(xiàn)貨） | 1.5 mL | emfret |
M130-1 | CD62P (P-selectin) | 1.5 mL | emfret |
M040-3 | GPIbalpha (CD42b)（現(xiàn)貨） | 1.5 mL | emfret |
M043-0 | GPIbalpha (CD42b) Xia.B2 Rat IgG2a purif. （現(xiàn)貨） | 0.5 mg | emfret |
M050-1 | GPIbbeta (CD42c)Xia.C3 Rat IgG2a FITC（現(xiàn)貨） | 1.5 mL | emfret |
M025-1 | Integrin alphaIIbbeta3 (GPIIb/IIIa, CD41/CD61) Leo.F2 Rat IgG2aFITC | 1.5mL | emfret |
M042-0 | Xia G7 Rat IgG1 purif（現(xiàn)貨） | 0.5 mg | emfret |
M051-1 | GPIX (CD42a) Xia.B4 Rat IgG1 | 1.5 mL | emfret |
M011-0 | GPVI JAQ1 Rat IgG2a purif（現(xiàn)貨） | 0.1 mg | emfret |
M021-1 | Integrin alphaIIbbeta3 (GPIIb/IIIa, CD41/CD61) Leo.H4 Rat IgG2b | 1.5 mL | emfret |
M130-2 | CD62P (P-selectin) Wug.E9 Rat IgG | 1.5 mL | emfret |
M050-0 | GPIbbeta (CD42c) mouse and humanClone：Xia.C3 Isotype：Rat IgG2a 標記：purif. | 0.5mg | emfret |
M043-1 | GPIbalpha (CD42b) Xia.B2 Rat IgG2a（現(xiàn)貨） | 1.5 mL | emfret |
M070-1 | Integrin alpha2 chain (CD49b, GPIa) Sam.G4 FITC | 1.5mL | emfret |
M071-1 | Integrin alpha2 chain (CD49b, GPIa) Sam.C1 FITC | 1.5mL | emfret |
M120-0 | CD31 (PECAM-1) Pec.H3 purif. | 0.5mg | emfret |
M051-0 | Purified Rat Anti-Mouse GPIX (CD42a) | 0.5 mg/mL | emfret |
P140-1 | fibrinogen polyclonal Rabbit IgGFITC FC | 1.5 mL | emfret |
P150-1 | von Willebrand Factor (vWF) | 1.5mL | emfret |
P190-2 | negative control polyclonal Rat IgGPE FC | 1.0 mL | emfret |
M030-0 | Integrin beta3 chain (GPIIIa, CD61) Luc.A5 Rat IgG2apurif. | 0.5 mg | emfret |
M025-2 | Integrin alphaIIbbeta3 (GPIIb/IIIa, CD41/CD61) | 1.5mL | emfret |
M025-3 | Integrin alphaIIbbeta3 (GPIIb/IIIa, CD41/CD61) | 1.5mL | emfret |
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